实验二  植物形态解剖基本技能的综合训练：徒手切片、石蜡制片

一、目的要求

    学习并初步掌握徒手切片制成永久保存片的方法。了解石蜡制片的过程。学习生物绘图的方法。

二、材料、用品

(一)材料

    已固定好的南瓜茎或其他植物的茎。

(二)用品

    显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、剃刀或保安刀、培养皿、吸水纸、纱布块、烧杯、擦镜纸、毛笔。

    1％番红水溶液、1％固绿酒精(或苯胺固绿)溶液、各级酒精、二甲苯、蒸馏水、加拿大树胶。

三、内容及方法

(一)徒手切片制成永存片

    徒手切片是用手持剃刀或保安刀片，将新鲜材料或预先固定好的材料(切前水洗)切成薄片，不经染色或经简单染色用水封片作临时观察，必要时经镜检后可选择好的薄片经过制片各步骤，也可制成永存玻片标本供长期使用。此方法优点是不需要复杂的设备，方法简便，制片迅速，而且能观察到植物组织的天然色泽和活体结构，常用于研究植物解剖结构、细胞组织化学成分、植物资源鉴定等，同时也是进行石蜡制片之前科学选材的一种常用简易制片方法。它有利于临时观察、较快地得到结果；其缺点是对于材料体积过小、太软、太硬材料则难于切片，同时不能做成连续切片。

1．材料准备和修整 一般应在适当时期选取发育正常、有代表性、软硬适度的新鲜根、茎、叶材料，用刀片将其切成2～3 cm长的小段，并将其切面削平；若为质地较软而薄的材料如叶片，可沿主脉两侧切成宽5～6mm、长1～1．5 cm的小块，夹在支持物(如萝卜、胡萝卜根、马铃薯块茎或通心草等)中进行切片。使用支持物时要先将支持物切成3～5cm长、0．5 cm宽的立方形小块，将其中部纵切一缝、然后将修整好的材料夹人其中与支持物一起切片。

2．徒手切片方法和步骤

(1)切片前在小培养皿内盛适量清水。

(2)切片时，右手拿刀片的右下方，左手的拇指、食指与中指夹住材料，拇指的位置稍低于食指，并使材料高出于食指2～3mm。切片前滴少许清水于刀面上，用以润湿材料减少切片阻力。切片时，将刀片平放在左手食指上，刀口与材料垂直，双手悬空，运用臂力，自左前方向右后方滑行连续进行切片，动作要敏捷，材料应一次切下，不要拉锯式切割，如此连续动作，切下数片后，用湿毛笔轻轻将薄片移入(1)中备用。

(3)用毛笔从培养皿中挑选薄而透明、平整的切片1—2片放在载玻片上，制成临时装片观察。

3．染色与保存

(1)临时观察和短期保存 为了使材料看得更加清楚可将其染色。常用染料有0．1％亚甲蓝、0．5％～1％中性红或1％番红水溶液等。染色方法是将选好的切片放在载玻片上，用吸水纸吸去多余水分，再滴一滴染料于切片上，加盖玻片进行观察；如果需短期保存，可在染色后在切片上滴一滴10％的甘油，再盖上盖玻片。加甘油的目的是增强切片透明度和避免切片失水变干、变黑。

(2)徒手切片制成永久保存片 染色方法很多，本次实验采取番红、固绿双重滴染的染色方法。

①染色：将选好的切片置于载玻片中央，加一滴1％番红水溶液，染色2—3min，倒掉染液，再滴蒸馏水洗去浮色(废液倒在另一培养皿内)。

②脱水：依次滴少许30％→50％→70％→80％→95％等各级酒精各0.5min进行脱水，每滴一滴酒精后将废液倒人废液培养皿中，注意防止材料掉人废液中。

③复染：倾去95％酒精后，加一滴1％固绿酒精液，复染20～30s，再滴以95％酒精或用无水酒精去浮色。

④脱水透明：倾去95％酒清，再加一滴无水酒精(两次)，然后经1/2无水酒精+1/2二甲苯→二甲苯(两次)每次2～3s，使材料完全透明。若材料出现乳状混浊，则说明脱水不净，需再用纯酒精脱水，按原步骤透明，透明后保持二甲苯不挥发(若已挥发应再滴一小滴二甲苯)，盖好盖玻片后观察。若需永久保存，可在加盖盖玻片前滴一滴加拿大树胶于材料上，再加盖玻片封藏，然后置玻片标本于30～35℃恒温箱中烘干。

    一张符合要求的切片要求薄(一层细胞)、平整、透明，染色红、绿分明。为了便于操作将上述程序表解如下：

    材料准备（长2-3cm ）--切片--镜检选片，要求切片平而薄--番红水溶液染色2-3 min, 蒸馏水去浮色--各级酒精脱水（30%-50%-70%-80%-95%）各0.5 min--固绿酒精溶液复染20-30s ,纯酒精去浮色--脱水、透明（每级2-3s ）--纯酒精-1/2二甲苯+1/2纯酒精--二甲苯两次--树胶封片。

(二)石蜡制片方法

    通过把材料包埋在石蜡里面，采用旋转式切片机切片及染色的制片法称为石蜡制片法。

    石蜡制片法的优点是：

1．一般的材料都适用，能将材料切成厚薄均一的薄片，其内部结构更清楚。

2．能切成连续蜡带，可观察细胞和组织的动态发生及层次变化过程，因此它是植物制片技术中应用最广的。

3．石蜡制片还是电子显微镜薄切片和超薄切片的基础，离开了石蜡制片就很难确定电镜制片样品的位置。

    缺点是：操作程序比较复杂，需要时间较长，有些质地过硬的材料也不宜采用；另外，石蜡制片需要一定条件和设备。

    石蜡制片程序如下：

第一步，材料采集、分割。采集材料应根据制片目的要求而定，材料要有代表性，无病虫害及其他损伤。分割材料要用锋利刀片，顺一个方向迅速切割。分割大小一般不超过0．5～1．5 cm3。如果是子房、花药，就不需进行分割。

第二步，杀死与固定。利用药剂迅速把细胞杀死，并尽量保持其生前的状态和结构。

    常用的固定剂有F．A．A、卡诺氏等固定液。将固定液放人有橡皮塞的小瓶中(可用青霉素、链霉素瓶代替)，将切割好的材料投人其中，盖好瓶盖，用注射针管抽去细胞间隙的空气，(或打开瓶盖，瓶口扎上纱布放在大的玻璃瓶内用抽气机抽气)，使固定液能迅速浸入材料。如用F．A．A固定液，固定24h后，材料仍可保存在固定液中备用。如用卡诺氏固定液，固定时间：根尖、花药15—30min，其他材料不超过24 h。材料固定好后用95％、85％酒精浸洗，每级约20min，然后保存在70％酒精中备用。

第三步，脱水。脱水目的是除去组织内多余的水分，便于透明剂渗入组织。常用脱水剂为酒精，其原则是从低浓度逐级移人高浓度，即由70％一80％一95％(加入少量的95％的曙红溶液)一无水酒精(两次)，每级停留3～4h，无水酒精每次停留1.5—3h。

第四步，透明、加蜡。透明目的是除去脱水剂，使材料透明干净增加折光系数；同时便于包埋剂(石蜡)得以进入组织中。常用透明剂为二甲苯和氯仿，使用原则也要逐渐进行，可减少材料收缩，即由1/2纯酒精+1/2二甲苯→二甲苯(两次)，每级为1～2h。二甲苯透明能力强但易于使组织收缩变脆，使用时不能在其中停留时间过长，同时脱水要干净。

    氯仿也是透明剂，它使材料收缩不太强烈并易挥发除去，但渗透力较弱，透明慢，能破坏染料，不宜用在染色后透明。

    氯仿在染色前透明，可采用五级进行，即1/5氯仿(4/5无水酒精) →2/5+3/5→4/5→纯氯仿(两次)，每级停留3～4h，在最后一次纯氯仿中，放人纯石蜡粉末数次，盖好瓶盖，置36℃温箱中24h，使材料慢慢浸蜡。

第五步，浸蜡、包埋。浸蜡的目的是逐渐除去透明剂，并为包埋剂——石蜡所代替，以便进行包埋。

    石蜡又是包埋剂，其熔点在42～60℃之间。软的材料用54—56℃熔点的石蜡。石蜡必须纯净，不含杂质。

    浸蜡也要渐次进行，为了操作方便，可配制各级蜡杯(采用小铝锅)，自制若干个铜纱活底的铝片盒，盒内插人材料编号纸扦，盒之间用回形针夹住固定，并置人自制铁丝篮中便成一整体。在换蜡时，只需提起铁丝篮，使蜡漏下，然后转移至下一级蜡杯中，各级蜡杯所需要的温度和时间如下：

50％石蜡(50％二甲苯)    40～42℃    0.5～3h
70％石蜡                48～50℃    0．5～3h
A杯纯蜡                 56～58℃    20min～l h
B杯纯蜡                 56—58℃    20min～l h
C杯纯蜡                 56～58℃    20min-l h

第六步，包埋。就是将已浸好蜡的材料连同熔化石蜡一起倒入定形的纸盒中，并根据需要把材料按一定间距调整好位置，使之凝固(待纸盒蜡面凝固后，即可将纸盒转入冷水盆中)，这样就把材料包埋在石蜡中，去掉纸盒后蜡块可长期保存备用。

第七步，修块与粘接。将已包埋好的蜡块，按需要切面(横切或纵切)，把大蜡块裁成小蜡块，用单面刀片去掉材料四周多余的石蜡成为大小适当的方块，并修出切面，修好的蜡块各边要平行，否则切出的蜡带不会平直，然后把蜡块底部牢固的粘接在木质蜡座上，以避免切片时脱落。

第八步，切片。用旋转切片机将蜡块切成连续蜡带(也可用滑走切片机切成不连续蜡片)，其厚度一般在8～14μm之间。

第九步，粘片与展片。在干净的载玻片上，用玻璃细棒取一小滴蛋清甘油于载玻片中央，以洗净的右手小指或无名指涂抹均匀，范围以足够粘贴蜡片为度，多余的粘贴剂应抹去(或用0．3％明胶水粘片)，在玻片左侧用记号笔写上编号，并加数滴蒸馏水于载玻片中央，取镜检合格的蜡片，以光亮的一面向下平放于载玻片的水面上，随后将已放材料的玻片，平放在35～40℃的展片台上，使蜡片展平(或在酒精灯上稍许加热)并摆好蜡片位置，去掉多余水分，放人摊片盘中，装满一盘后移至恒温箱中(38～40℃)继续烘干(常需2～3d)备用。

第十步，脱蜡、染色制片。用二甲苯脱蜡，先将二甲苯盛人染色缸中(容量为缸的4/5)，将已烘干待脱蜡的玻片放人缸中10～15min，使石蜡完全溶解。

    染色制片：染色方法很多，根据制片目的而定，可以采用番红、固绿双重染色(和徒手切片染色方法相同)，也可采用铁矾苏木精染色或其他染色方法。下面介绍铁矾苏木精染色制片方法，此法最适宜观察子房、胚珠及胚囊结构。

    染色制片方法步骤如下：

(1)复水  经各级酒精到蒸馏水。即滴人无水酒精→95％→80％→，70％→50％→30％各级酒精一蒸馏水，每级4～5s。

(2)媒染  4％铁矾媒染10 min。

(3)水洗  0．5％苏木精染色10 min，然后插入切片架中，将切片架放人瓷盘中用细橡皮管流水冲洗5 min。

(4)分色  用2％铁矾分色至适度(镜检确定)。

(5)水洗返蓝  将玻片插入切片架中，用自来水流水洗10～15 min至返蓝色。

(6)脱水、复染及透明 滴人蒸馏水→30％→50％→70％→85％各级酒精一含1％伊红的95％酒精溶液复染→无水酒精→1/2无水酒精十1/2二甲苯→二甲苯(两次)，置二甲苯透明缸中透明，加拿大树胶封片。

    制片效果：细胞核紫蓝色，其余部分红色。

四、作业与思考题

1．绘几个厚角组织与薄壁组织的细胞。

2．制作一张较合格的切片。

3．要想徒手切出一张好的切片，要掌握哪些关键技术?

要想绘出一张好的生物图，应注意哪几点?